浊度法测定硫酸小诺霉素效价的方法

来源:/ 编辑:余氯检测仪 时间:2019-01-04

  [摘要] 目的:建立浊度法测定硫酸小诺霉素效价的方法。方法:采用浊度法测定硫酸小诺霉素的效价,并将浊度法与管碟法测定结果相比较。

  结果:浊度法与管碟法测定结果一致,浊度法测定结果可信限率较低。结论:本法简便、快捷,可用于硫酸小诺霉素的效价测定。

  [关键词] 浊度法;硫酸小诺霉素;效价;管碟法

  硫酸小诺霉素为广谱氨基糖苷类抗生素,耳毒性和肾毒性较低,对6-N-乙酰酯酶抗药性菌有效,有强大和快速的抗菌能力,在治疗由革兰阴性菌如铜绿假细胞菌、大肠埃希菌等引起的感染时,与内酰胺类抗生素有协同作用。目前该药物及其制剂采用管碟法作为含量测定的方法,但管碟法为传统方法,虽能直观反映其体外抗菌能力,但是管碟法进行过程中影响因素颇多,而且消耗人力大,花费时间长;浊度法既能弥补这些缺点,又具有测定结果精密度高。本研究建立浊度法测定硫酸小诺霉素效价的方法,即可直观反映药物的抗菌活性,又可在检测当天获得结果,灵敏、快速,可作为硫酸小诺霉素效价的测定方法[1]。

  1 仪器与试药

  1.1 仪器

  抑菌圈测量分析仪ZY-300IV型、微生物比浊法测定仪WBS-100型(北京先驱威锋技术开发企业);BP-211D分析天平(SARTORIUS企业);UV-2401型紫外分光光度计(日本岛津)。

  1.2 试药

  大肠埃希菌[CMCC(B)44103];硫酸小诺霉素标准品(批号:130342-200703,效价:574 U/mg);培养基Ⅲ(批号:060403,中国药品生物制品检定所);硫酸小诺霉素原料药(山西省侯马市平阳制药厂);氯化钠,磷酸氢二钾,磷酸二氢钾,均为分析纯。

  2 方法与结果

  2.1 实验条件

  2.1.1 大肠埃希菌悬液的制备取大肠埃希菌[CMCC(B)44103]的营养琼脂斜面培养物,接种于营养琼脂斜面上,在35~37℃培养20~22 h,然后用灭菌水将菌苔洗下,并加灭菌水稀释,使其在580 nm波长处的吸取度为1.0。

  2.1.2 试验菌悬液加入量的选择 取大肠埃希菌悬液,加入到培养基中,制成含菌浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%的培养基,培养2.5 h,在580 nm处测定吸取度,结果含3%菌液浓度在3%时,吸取度为0.52,符合要求,故选3%的菌液浓度。

  2.1.3 抗生素溶液配制精密称取标准品和原料药适量,加灭菌水溶解,配制成1 000 U/mg的溶液,精密量取此溶液适量,用灭菌磷酸盐缓冲液(pH=7.0)稀释至最终浓度为10 U/mg和20 U/mg(剂间比为1∶2)。

  2.1.4 抗生素溶液的分装 取已灭菌的石英比色管16支,分别为ds14支、ds24支、dT14支、dT24支,分别标记,精密量取标准溶液ds1、ds2及dT1、dT2各1.0 ml,按编号加入相应比色管中。

  2.1.5 含菌培养基的分装在培养基中加入一定量试验菌(3%),用已灭菌的刻度吸管分装至比色管中,每管分装9.0 ml,马上振摇,混合均匀。

  2.1.6 培养、测量与计算使用WBS-100微生物比浊仪,恒温培养,定时振荡,在线测量,计算结果[2]。

  2.2 线性范围考察

  称取标准品适量,加灭菌水制成1 000 U/mg的溶液,分别精密汲取此液适量,用灭菌磷酸盐缓冲液(pH=7.0)稀释成8、10、12、16、20、24、30、35、40 U/mg的溶液。分别精密量取上述各溶液1.0 ml,置灭菌比色皿中,每个浓度3管,分别加入含菌培养基9.0 ml,马上摇匀,在浊度测定仪中培养3.5 h,以培养基为空白,在580 nm处测定吸取值,以吸取值(A)为纵坐标,以浓度(C)的对数为横坐标,进行线性回归,回归方程为Y=2.634 2-1.294 6lgC(r=0.998 2),说明在40~80 U/mg浓度范围内,抗生素浓度的对数与吸取值线性关系良好[3]。在线性浓度范围内选取硫酸小诺霉素的高低剂量在24、12 U/mg所测定的A值基本在0.4~0.6范围内,高低计量为2∶1,可作为效价测定的抗生素溶液浓度。培养基接种菌量约为3%,菌悬液在580 nm处的吸取度为约1.0,试验结果较为理想。

  2.3 准确度与精密度考察

  2.3.1 回收率试验选择 90%、100%、110%三点进行回收率试验。①90%样品溶液制备:分别精密汲取上述标准品溶液(1 000 U/mg)4.5、9.0 ml,用pH=7.0的磷酸盐缓冲液稀释成高低浓度分别为9、18 U/mg的抗生素溶液。②100%样品溶液制备:分别精密汲取上述标准品溶液(1 000 U/mg)5、10 ml,用pH=7.0的磷酸盐缓冲液稀释成高低浓度分别为10、20 U/mg的抗生素溶液。③110%样品溶液制备:分别精密汲取上述标准品溶液(1 000 U/mg)5.5、11.0 ml,用pH=7.0的磷酸盐缓冲液稀释成高低浓度分别为11、22 U/mg的抗生素溶液。分别取上述溶液,按照浊度法操作,结果回收率分别为100.51%、100.27%、100.34%。

  2.3.2 重复性试验 取同一批样品,配制6份供试品溶液,进行测定,于1 d内完成,结果6份供试液效价均值为562 U/mg,RSD为5.8%。提示该抗生素溶液不宜久放,时间因素对测定结果影响较大,试验时溶液应临用新制。

  2.3.3 样品含量测定取硫酸小诺霉素标准品及样品适量,精密称定,用灭菌水制成1 000 U/mg的溶液,分别精密汲取此液适量,用灭菌磷酸盐缓冲液(pH=7.0)稀释制成10、20 U/mg浓度的高低剂量溶液,高低计量剂间比为2∶1,分别精密量取上述溶液各1.0 ml,置灭菌比色管中,各6管,分别加入3%大肠埃希菌液培养基9.0 ml,马上摇匀,在浊度测定仪中培养3.5 h。按“2.1.6”项下方法测定。阴性对照:pH=7.0磷酸盐缓冲液1.0 ml,加9.0 ml未接种实验菌的培养基。分别用浊度法与管碟法的二剂量法对5批硫酸小诺霉素原料药进行测定,并测定结果进行比较(n=5),结果见表1。

  表 1 浊度法与管碟法的测定结果比较

  原料药标示效价:574 U/mg

  对样品及原料药用比浊法和管碟法测得的含量和可信限率FL(%)进行t检验,结果无显著性差异(P>0.05),比浊法的可信限率优于管碟法[4]。

  3 讨论

  试验菌必须具有稳定性,对于实验来说,它是决定性因素,因此在菌悬液的制备过程中,需严格控制菌种斜面的质量和菌种培养的温度和时间。培养温度为37℃,时间应不少于22 h,菌液应质细、均匀[5]。

  试验菌的稳定性实验用培养基必须色泽浅、质澄清,灵敏度应高,应能保证试验菌生长良好。特别要控制pH值,若pH值不适合,试验菌生长缓慢,在规定时间内形成的浊度达不到要求。若增加培养时间,则实验精密度随之较差[6]。

  试验中严格防止微生物和抗生素的污染相对而言,微生物污染对浊度法的影响要比管碟法要大,浊度法培养时,比色管必须洁净,其他抗生素或污染菌与试验菌混合在一起同时生长,这样将导致生物反应紊乱,造成同浓度各管的吸取度差别增大,可信限率显著增高,影响效价测定结果的精密度与准确度[7-8]。

  试验中温度对结果的影响较大,应保持温度恒定、均匀,各管如受热不够均匀,则平行试验的结果不好,所以各管应随机放置,以消除局部温度不均匀对细菌生长的的影响。定时振摇可使细菌均匀生长,上下浊度一致,缩短实验时间。

  试验中培养时间控制得是否准确也非常重要,试验时各管最好按一定时间间隔加入含菌培养基,测量时也按同一时间间隔测量,控制试验偏差较小在较小的范围内(±5%)。

  实验表明,采用浊度法与管碟法测定硫酸小诺霉素原料,结果一致,浊度法操作方便,重现性较好,可以用于硫酸小诺霉素原料的效价测定。本次研究还考察了浊度法测定硫酸小诺霉素制剂效价的可行性,结果表明浊度法完全可以用于测定该品种片剂,实验中若将高低浓度抗生素溶液过滤,则可减小辅料的影响,结果的可信限率将更低。

  [参考文献]

  [1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].二部.北京:化学工业出版社,2005:附录82.

  [2]武德仁,毛影.硫酸粘菌素效价测定方法的探讨[J].中国药师,2007,9(12):100-101.

  [3]冯向东,高光伟.浊度法测定吉他霉素的效价[J].西北药学杂志,2008, 23(5),270-271.

  [4]黄赐煌,王红梅,邱涵,等.浊度法测定阿奇霉素的效价[J].海峡药学,2007,19(12):45-47.

  [5]王金龙,高燕霞,刘云,等.浊度法测定四环素的效价[J].药物分析杂志,2007,27(12):1988-1990.

  [6]刘英,崔春英,席德荣,等.比浊法自动测定麦白霉素制剂的效价[J].中国药学杂志,2007,42(8):1251-1254.

  [7]张菁,杨梁,姜建国.浊度法测定地红霉素效价[J].药物分析杂志,2007, 27(3):342-344.

  [8]姜建国,高燕霞,韩斌.浊度法测定磷霉素钙胶囊的效价[J].中国药师,2008,11(11):1271-1272.

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