动态浊度法定量检测清开灵注射液中细菌内毒素

来源:/ 编辑:余氯检测仪 时间:2019-01-04

  [摘要] 目的:建立定量检测清开灵注射液中细菌内毒素的方法。方法:采用《中国药典》2005年版二部附录中的动态浊度法检测细菌内毒素。结果:用此法检测时无干扰因素影响,内毒素回收率为50%~200%。结论:使用动态浊度法定量检测清开灵注射液中细菌内毒素是可行的,此方法既可避免兔热原检查法操作复杂的缺点,同时又避免了限量法检测内毒素时的干扰。

  [关键词] 清开灵注射液;细菌内毒素;动态浊度法;干扰试验

  [中图分类号]R927.12 [文献标识码]B [文章编号]1673-7210(2009)03(a)-057-02

  清开灵注射液为中药注射剂,是安宫牛黄丸的改型制剂。临床上用于治疗热病神昏、中风偏瘫、意识不清,也可用于急慢性肝炎、乙型肝炎、上呼吸道感染、肺炎、高热以及脑血栓形成、脑出血见上述症状者,其临床应用广泛、用量大,又为中药制剂,因而对其进行热原控制具有重要意义。因细菌内毒素限值检查具有较大的干扰性,而选用动态浊度法测定细菌内毒素可消除干扰,结果准确、可靠。该品种部颁规定的检查项是热原检查,本法参照《中国药典》2005版二部附录中细菌内毒素的检查法,对清开灵注射液中细菌内毒素检查法的可行性进行探索,旨在建立一种快速检测该注射液的方法,并对其进行添加内毒素回收试验及热原检查对比试验,来证实此法的可行性。

  1仪器与试药

  BET-32C细菌内毒素测定仪(天津大学无线电厂);清开灵注射液(批号20070204、20070607、20070512,河北神威药业有限企业);TAL试剂(批号20070206,λ为0.03 EU/ml,规格0.5 ml/Amp,湛江海洋生物制品检定厂);细菌内毒素标准品(批号2007-7,120 EU/Amp,中国药品生物制品检定所);细菌内毒素检查用水(批号20061208,规格10 ml/Amp,湛江海洋生物制品检定厂)。

  2方法与结果

  2.1 细菌内毒素限值的确定

  公式为L=K/M,K为规定的给药途径,即人均每千克体重每小时可接受的最大内毒素剂量,注射剂规格为5.0 EU/kg;M为1 h每千克体重的最大给药剂量,为10 ml/kg,清开灵注射液的人均最大给药量为40 ml。中国人的体重按60 kg计,计算得样品的内毒素限值L为7.5 EU/ml。

  2.2 标准曲线的制备

  用细菌内毒素检查用水将内毒素标准品稀释240~1 200倍,最终得细菌内毒素浓度为0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 3 EU/ml的系列稀释溶液;各取0.1 ml分别加入预先加有0.1 ml TAL试剂的反应管内,混合均匀,马上插入BET-32C细菌内毒素测定仪内进行自动检测,其中每一个浓度重复3管。结果见表1。

  得回归方程lgT=3.112-0.320 2lgC,其中相关系数r=-0.998 6,最低浓度λ1=0.031 3 EU/ml,空白对照管在检测时间外,故标准曲线成立。

  表 1 标准曲线的相关信息

  2.3干扰试验

  2.3.1 样品稀释倍数的计算公式为MVD=(L?C)/λ1。L为清开灵注射液内毒素限值,C为1.0 ml/ml,λ1为标准曲线的最低内毒素浓度0.031 3 EU/ml,计算得清开灵注射液最大有效稀释倍数MVD为240倍。

  2.3.2 样品溶液的配制及干扰试验将清开灵注射液用内毒素检查用水依次稀释为30、60、120、240倍的溶液,记为A1液;同时,另取4管,进行相同倍数稀释,但在稀释液中添加浓度为M(4λ1)的细菌内毒素标准溶液,作为样品添加内毒素阳性对照管,记为B1液;分别取上述各液0.1 ml,加入预先加有0.10 ml TAL试剂的反应管内,混匀马上插入BET-32C细菌内毒素测定仪内进行检测,其中每一个浓度重复3管,计算回收率。回收率(%)=(B1液内毒素值-A1液内毒素值)/M×100%。结果见表2。

  样品添加内毒素的平均回收率均在50%~200%范围内,符合《中国药典》2005年版有关规定,表明样品的4个不同浓度溶液对TAL无干扰。

  表 2 清开灵注射液的干扰试验

  2.4 样品溶液的回收率试验

  分别取3批清开灵注射液,用细菌内毒素检查用水制成4倍稀释液,记为A2液;同时,另取4管进行4倍稀释,并在稀释液中添加浓度为M(4λ1)的细菌内毒素标准溶液,记为B2液;分别取上述各液0.1 ml,加入预先加有0.10 ml TAL试剂的反应管内进行检测,其中,每一个浓度重复3管,计算回收率。结果见表3。

  3批清开灵注射液的回收率均在50%~200%范围内,表明清开灵注射液在本实验条件下对TAL试剂无干扰影响,因此日常检验选用240倍即可。

  表 3 清开灵注射液的回收率试验

  同时,进行3批供试品的家兔热原检查对比试验,结果一致,均为阴性。

  3讨论

  从清开灵注射液的干扰试验结果可知,用细菌内毒素动态浊度法检测时,由于内毒素回收率在50%~200%范围内,表明不存在干扰因素的影响,且3批清开灵注射液的内毒素含量均在规定限度7.5 EU/ml以下。

  用传统的家兔法检测细菌内毒素,由于操作复杂、影响因素多,对试验结果影响很大;动态浊度法具有操作简便、结果准确、检测灵敏度高等优点,避免了由于家兔及人为主观判断差异所导致的假阳性或假阴性结果。经过对比试验,样品的细菌内毒素定量检测结果与家兔热原检测结果一致,说明使用细菌内毒素动态浊度法测定清开灵注射液中细菌内毒素是可行的。

  [参考文献]

  [1]国家药典委员会.中国药典[S].二部(附录XI E).北京:化学工业出版社,2005.85.

  [2]EP Supplement[S].2000,41.

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